Convalida Knockout
L'esigenza
Gli anticorpi sono tra gli strumenti più usati nelle Life science per studiare le proteine e le loro funzioni all'interno dei vari percorsi biologici e patologici. Con la loro specificità e sensibilità, gli anticorpi possono aiutare a identificare facilmente la proteina di interesse a vari livelli di espressione. Tuttavia, un numero crescente di studi hanno dimostrato che non tutti gli anticorpi sono specifici, portando ad un numero crescente di irriproducibilità sperimentale. (Bradbury & Plückthun, 2015; Baker, 2015; Mullane et al., 2015).
La soluzione: convalida knockout
Uno dei processi di validazione maggiormente riconosciuto e affidabile per la specificità anticorpale è la validazione knockout (Madhusoodanan, 2014; Rhodes & Trimmers, 2008). Tale validazione prevede che la specificità anticorpale sia confermata testando l'anticorpo di interesse su un campione knockout o una linea cellulare che non esprime la proteina bersaglio. In una linea di cellule knockout, il bersaglio anticorpale non è presente poiché il gene che codifica per la proteina di interesse viene eliminato o "knocked out". I risultati vengono confrontati con una linea cellulare normale. Se l'anticorpo è veramente specifico non deve portare ad alcuna rilevazione nella linea cellulare knockout, dando invece un segnale specifico nella linea cellulare normale. La validazione Knockout assicura l’uso di un effettivo controllo negativo per confermare la specificità dell'anticorpo alla proteina di interesse (Bordeaux, et al., 2010).
Abcam e la validazione Knockout
Abcam ha inserito la convalida knockout tra i controlli standard per i suoi anticorpi. Attualmente vengono testati tramite questa metodologia circa 500 anticorpi all’anno.